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梯度生产器
发布日期:2023-08-01    人气:720
 
梯度生成器构造简单,装配简易,梯度性能好,有不同规格备选:RDY-TD15,RDY-TD25,RDY-TD35 小型梯度生成器适
于采用蔗糖或氯化铯溶液制备离心梯度。RDY-TD50,RDY-TD100 大型梯度生成器主要适用于制备线性梯度聚丙烯酰胺凝
胶。
梯度生成器均由双腔体组成,一个为蓄存腔,一个为混合腔,备有一互通阀,第二个阀门调控混合腔输出流量。混合腔中置
一磁力搅拌棒以确保恒定梯度。所有梯度生成器底部平坦,可放置到磁力搅拌器上。
1. 制备平行胶:
平行胶中从上至下变性剂的浓度递增。这种胶适用于分析大量样品。
1)与制备标准聚丙烯胺凝胶一样制备胶板。
2)从丙烯酰胺和两种变性剂贮存液中取两份等体积溶液以符合要求的变性剂浓度范围。溶液的总体积一般为刚好覆盖胶板。
丙烯酰胺的浓度取决于 DNA 片段的大小,对于 DNA 片段大小为≥300bp 的丙烯酰胺的浓度为 6%,而长度<300bp 的 DNA 片
段,丙烯酰胺的浓度为 12%。
3)加高浓度变性剂溶液到梯度生成器右槽中(该溶液将首先通过梯度合成器进入胶板间的空隙),打开连接梯度生成器两端的
开关,让一些溶液流入左槽内关上开关,用吸管把它们移回到右槽(目的是确保两槽之间无气泡的阻隔)。然后把低浓度变性
剂溶液加到梯度生成器左槽中。
4)搅拌这两个槽中溶液的同时向其中加入 4.5μL/mLl0%的过硫酸铵和 1μL/mL 的 TEMED(N,N,N',N',—四甲基乙二胺)。
5)轻轻打开两槽之间的开关及梯度生成器出口的开关,灌胶时两槽内的溶液应处于搅拌状态(尤其高浓度溶液槽更应搅拌),
溶液受重力影响通过一个放在两块玻璃板之间的顶部的细塑料管流过梯度生成器。流速应保持一定大小以保证溶液在凝聚之
前所有溶液都应注入到两层玻璃板之间。(凝聚速度可通过调整过硫酸铵和 TEMED 的浓度来调节)。
6)胶板充满后,在其顶部插入梳子并将其放平,凝聚至少 30min。(胶可事先灌好并于 4℃贮存几天)。
2.制备垂直胶:
垂直胶含有丙烯酰胺的浓度是固定的,垂直于电泳方向有一个线性递增的变性剂梯度。这种胶适用于确定分离含有核苷酸改
变的 DNA 片段的最佳梯度范围。垂直胶的制备大体相似和平行胶的制备,但也有所不同:
1)像标准的聚丙烯酰胺凝胶一样制备胶板,但其顶部不插入梳子。
2)准备一块比梳子稍短的涂上润滑剂的间隔片插在梳子的位置,位置稍突出一些,这样左边就留下一个缺口。用夹子夹紧这
一边。把胶板旋转
90°这样和缺口相连的这一面就转到最上面了。胶液将通过该缺口进入两玻璃板之间。如前所述的方法
灌胶。
3)胶完全凝固之后,将胶板垂直立起,轻轻移出胶顶部的间隔片。胶的顶部就会出现大而平的孔,这样就可以进行电泳了。

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